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FCM在生物医学工程学方面的应用,DNA含量与滑膜肉瘤预后关系的研究

流式细胞术在细胞生物学、分子遗传学、微生物学、免疫学、分子生物学以及临床肿瘤学、临床血液学等诸多领域都有广泛应用。本节 概要介绍它们的技术途径及主要原理,大家可以从中看出它们是和细胞化学密切相关的。

核心提示:一、流式细胞仪的检测范围1.流式细胞仪可以检测细胞结构,包括:细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周

DNA含量分析技术是80年代以来迅速发展的一门新型检测技术,已广泛应用于肿瘤临床及基础理论的研究。其中流式细胞术(Flowcytometry,FCM)是一种快速定量分析细胞核DNA含量的技术,其在推测患者预后及治疗反应上具有重要的价值[1]。滑膜肉瘤的组织结构复杂,目前尚无统一的分类及预后判定标准。研究表明,滑膜肉瘤患者的预后与其肿瘤细胞核的有丝分裂率有一明显的相关性[2],因此,我们拟应用FCM对其进行回顾性研究,探讨DNA含量在滑膜肉瘤患者预后判定中的作用。

核心提示:1 用于血液/肿瘤细胞增殖动力学研究 细胞经DNA荧光染料如碘化丙啶、溴化乙啶、Hoechst等标记后,

一、FCM应用的技术途径

一、流式细胞仪的检测范围1.流式细胞仪可以检测细胞结构,包括:细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、RNA 含量、蛋白质含量。2.流式细胞仪可以检测细胞功能,包括:细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。二、流式细胞仪的临床应用1.流式细胞术在肿瘤学中的应用:流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡;2.流式细胞术在血液学中的应用:检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测;3.流式细胞术在免疫学中的应用:可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。三、流式细胞仪的科研应用主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。四、流式细胞术常规检测时的样品制备 直接免疫荧光标记法取一定量细胞,直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应,孵育20-60分钟后,用PBS(pH7.2 - 7.4)洗1-2 次,加入缓冲液重悬,上机检测。本方法操作简便,结果准确,易于分析,适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高,但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰,因此更适用于临床标本的检测。 间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液,先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,再加入荧光标记的第二抗体,生成抗原-抗体-抗抗体复合物,以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低,二抗应用广泛,多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。

1 材料与方法

1 用于血液/肿瘤细胞增殖动力学研究 细胞经DNA荧光染料如碘化丙啶、溴化乙啶、Hoechst等标记后,FCM可测定单个细胞DNA的含量,并描绘出DNA图形,经软件处理可计算出G0/G1、S、G2/M各细胞周期细胞所占的百分比。依据增殖指数可了解群体细胞的增殖活力。焦宁Y与FITC分别是RNA与蛋白质的特异性染料;PI与F1TC双染可测知单个细胞内DNA与蛋白质量的变化;丫啶橙染色法不仅可测定单个细胞DNA与RNA含量,还可区分出Go与G1期细胞;若丹明123(rhodamin 123)是线粒体特殊染料。通过以上各种特殊染色法,不仅可了解血/肿瘤细胞的增殖状况,更可用于化疗药物作用机制的探讨,从而将其区分为增殖周期特异性、非特异性药物,以及周期时相特异性、非特异性药物,以便更合理的配伍联合化疗方案,预测肿瘤细胞对药物的敏感性等。 单参数DNA图形或AO染色DNA/RNA双参数法可显示非整倍体峰,理论上其灵敏度达万分之一。非整倍体细胞是肿瘤细胞的特异标志,在实体瘤中检出率为80%-90%,在白血病中约为30%-40%。非整倍体细胞克隆在肿瘤完全缓解期消失,复发前重现。因而FCM-DNA非整倍体测定在肿瘤的诊断、残存肿瘤细胞监测及预示预后中有重要价值。用抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷单抗法可测定细胞倍增时间与各时相时间,用抗周期蛋白单抗可研究周期蛋白对细胞周期的调控。

FCM是通过测量细胞的多种参量来获取信息的。细胞参数分为结构参量和功能参量两大类。结构参量主要用于描述细胞的化学组分和形态特征;功能参量主要是描述细胞整体的理化和生物特性。这些参量有的需要经荧光标记方可测定,有的并不需要荧光标记。DNA以及RNA的含量,蛋白总含量、胞内pH值和细胞大小等为结构参数;细胞周期动力学、特殊配体的鉴定、特殊细胞的生物活性等则为功能参数。

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1.1临床资料

2 用于白细胞检测2.1 白血病或淋巴瘤免疫分型 虽然至今尚未发现白血病或淋巴瘤的特异抗原,更没有各亚型的特异抗原,但根据分化阻抑学说,在白血病或淋巴瘤中,某系列、某分化阶段的细胞必然大大超过正常比例,因此可以利用正常血细胞系列的特异性及分化阶段特异单抗来进行分型。FCM免疫分型有以下优点:

1.DNA和RNA的测量和分析DNA和RNA的含量可以用多种荧光探针标记后测出。对细胞内DNA含量的测定可用于细胞生物学方面的研究和临床肿瘤学的诊断;测量RNA的含量可用于血液中的网织红细胞的检测和计数;DNA和RNA含量的测定可以用于区别细胞周期中的G0和G1期。常用的荧光探针有吖啶橙、派洛宁Y、HO系列和色霉素A3等。利用HO/CA3双染色还可分析DNA的碱基组成。还可以结合Brdu (Bromodeoxyuridine, 溴脱氧尿嘧啶核苷)单克隆抗体免疫荧光来测定细胞内DNA合成。

1.1.1资料选择选择1984年至1993年在我院进行诊治的原发滑膜肉瘤52例,病例资料完整,术前均未进行化疗及放疗,行软组织肿瘤扩大切除术,术后采用VAMC方案进行化疗。其中男性30例,女性22例;男女之比1.4:1,34例分布于 30~50岁之间,占本组资料的65.5%。

2.1.1 形态学检查的可靠性取决于检查者的经验,而FCM则是根据特异性单抗客观、快速地确定细胞的来源与性质。比如,FCM可以判断形态学难以分辨的髓系细胞和淋巴细胞,可以分辨T及B淋巴细胞,即FCM免疫分型法可明确区分粒细胞和淋巴细胞白血病,以及T细胞和B细胞性白血病或杂合性白血病。

2.蛋白质总量测定用FCM可以测定细胞中蛋白的总含量,以检测一个细胞群体生长和代谢的状态,或区别具有不同蛋白含量的细胞亚群,如血液中的白细胞的分类。检测总蛋白的常用荧光探针为异硫氰基荧光素,FITC以共价键方式与蛋白上带正电的残基结合。

1.1.2肿瘤大小、局部浸润及临床分期52例肿瘤最大直径21cm,最小直径2cm,其中6例≤5cm,余46例肿瘤直径均>5cm。经病理证实6例局部骨侵袭,7例区域淋巴结转移。根据软组织肉瘤临床分期标准进行临床分期[3],其中Ⅲa6例,Ⅲb33例,Ⅲc7例,Ⅳa6例。

2.1.2 对于急性粒细胞白血病亚型的诊断,单纯FCM免疫分型还难以得出肯定的结论,但可提供倾向性参数。比如,CD34+, HLA-DR+ 者以FAB-M2或M1型可能性大;两者均阴性且CD33+、CD13+ 者多为FAB-M3型;CD14,CD41则分别是单核细胞与巨核细胞的标志。

3.特殊配体的测定配体是与不同的细胞结构特异结合很强的各种大分子和小分子,通过对特异性的荧光标记的配体的测定可以获得不少有关结构参量和功能参量的信息。例如用标记的外源凝集素可检测细胞表面糖;用标记抗体可测表面抗原;用标记多聚阳离子可检测细胞表面电荷;用标记的激素、生长因子、神经递质和病毒等可检测细胞受体;用标记的大分子、微生物等可检测细胞的内吞性;用荧光素标记的亲和素以及带有DUTP的生物素衍生物的DNA探针跟靶细胞的DNA杂交能够检测原位的特殊基因等。这方面的应用范围广、有前途,已经成为研究细胞和组织中的抗原、基因和各种生化过程的强有力的新技术。用于这方面工作的荧光探针主要有FITC、若丹明系列、藻胆蛋白系列等。由于各种荧光探针具有不同的光谱特性,在使用中要注意正确地使用激光光源和滤片。

1.1.3随访本组资料平均随访日期为41个月,最长为62个月,最短为17个月。所有患者术前均经X线证实无1例肺转移,治疗后经X线证实肺转移21例。

2.1.3 多色荧光标记法可测知一个细胞上是否有共表达的抗原,借此可确定双克隆或双表型白血病。

4.生物活性的测定就生物流行性来说,主要包括两方面工作:①细胞本身的死活;②活细胞生物功能发挥的强弱。前项工作单一,后项工作要复杂得多。FCM用来判断细胞死活的常用荧光探针有二大类:一类是能透过活的细胞膜进入细胞内而发出荧光的物质;例如下醋酸酯荧光素它可被活细胞持留而发出黄绿色荧光;若细胞有损伤则会从细胞中流失,观察不到荧光。另一类是不能透过活细胞膜,但能对固定的细胞及膜有破损的细胞的核进行染色,例如碘化丙啶和溴化乙锭就是常用的第二类荧光探针。

1.1.4病理分型对全部病理资料重新进行复查,根据肿瘤细胞有向上皮成分和梭形成分双向分化的趋势,将滑膜肉瘤分为单相型及双相型。

2.1.4 联合使用免疫荧光与DNA双染色法,对有非整倍体者可确定其克隆来源。 基于上述优点,FCM一免疫分型已成为诊断白血病、淋巴瘤的必要依据。然而血、肿瘤细胞的特性决定了其表型的异质性,因此当出现髓系与淋巴系标志共存时,难以确定是白血病的异质性还是杂合性白血病,但是这种特殊表型可作为残存白血病细胞的标志。

用FCM来测定活细胞生物功能发挥方面和性能的指标很多。例如可用来测细胞膜电位、细胞内pH值和细胞内钙等,这些都和细胞的激活密切相关。FCM也可用来测膜结构的流动性或微粘度等。有报告可以用FCM代替51Cr的放射免疫分析来测定天然杀伤细胞对靶细胞毒理学活性的大小。

1.2滑膜肉瘤流式细胞分析及方法

2.2 用于白细胞分类计数和白血病形态学的分型 电阻抗法白细胞“分类”只是根据加入溶血剂后,变化了的白细胞形态的大小。根据电信号进行分析。其只是根据细胞体积大小不同的特征,并未分析细胞核、浆形态特点。因此只能是细胞大小的“分群”而不是分类。 流式细胞术是通过激光检测细胞,激光束可直接射入细胞,细胞的核、浆特征不同,给予的检测信号不同,因而可较准确的进行细胞分类。除此以外,有些仪器还可以分析幼稚白细胞,甚至进行白血病分型的初步分析。比如笔者研究证明ADVIA 120 血细胞分析仪因为使用细胞化学和激光两种技术进行综合分析,就可以用末梢血(白血病细胞比例>70%)进行以仪器分析,根据报告的散点图,初步诊断出是淋巴细胞白血病和髓细胞白血病。

二、FCM的典型应用简介

1.2.1样品来源确含肿瘤组织的石蜡包埋的组织块在切片机上切取35μm厚组织片7片,经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,胃蛋白酶消化,再以300目尼龙筛网滤去未消化的组织碎片,用75%的乙醇固定制备好的单细胞,4℃保存,备检。

3 免疫功能测定 常用的测定是CD3,CD4,CD8,T,B细胞的比例及NK细胞(CD56,CD18)。CD5+B细胞在免疫性疾病、胶原性疾病中起重要作用;CD4+ 细胞绝对值小于400/ml是AIDS病的早期表现。

下面简单介绍FCM在各个领域中应用的典型实例,以求对FCM应用的全面了解,并能深入了解FCM在免疫细胞化学中应用的背景。

1.2.2制备好的单细胞悬液涂片,HE染色,显微镜下检查肿瘤消化情况,了解单细胞悬液的产量。1.2.3应用溴化乙啶一步插入法进行染色,检测前弃去待测样品中的乙醇将细胞调整至1×104个/ml,在其内加入5%的鸡红细胞作对照与标本同步染色。

4 用于网织红细胞分析 前已述及,由于激光束可摄入细胞内,因而可进行红细胞内容物的分析,网织红细胞浆内含有一定量的RNA,经染色后可显示网织结构且其形式与RNA 含量有关。流式法血细胞分析仪根据这一原理可将网织红细胞分成三群,即早期网织红细胞、中期网织红细胞和晚期网织红细胞。这三型网织红细胞比例变化,有以下临床意义:贫血的诊断和鉴别诊断。贫血的疗效观察,凡贫血治疗有效者,笔者动态观察指标变化显示HFR比率的升高可早于Hb变化3~5d,早于MCV变化5~7 d。肿瘤治疗过程中,了解骨髓内造血状态。笔者研究表明HFR+MFR的比例变化,可作为了解造血状态的指标。当骨髓造血功能受抑制时,HFR+MFR比例的减低要早于周围血白细胞总数的减少;当骨髓从受抑制状态恢复时,HFR+MFR的比例升高也早于白细胞总数的变化。有些血细胞分析仪除HFR、MFR和LFR以外,还可提供网织红细胞体积、网织红细胞含量、网织红细胞体积分布宽度和网织红细胞血红蛋白浓度等参数,对贫血的诊断、鉴别诊断和疗效观察有一定的意义。

1.在细胞生物学方面的应用细胞生物学是FCM应用最广泛也是最基本的领域,细胞周期分析是其基本分析内容之一,而实施的技术途径是通过测定细胞周期各时相的DNA含量来达到的。

1.2.4用美国产FACS-420型流式细胞仪检测样品,波长488nm,功率为300mW的氩离子为激发光源,变异系数稳定在5%以内,每例标本测定1.5万~2.5万个细胞,平均为2万个。

5 用于网织血小板分析 1969年Ingramhe和Coopersmith用美蓝染料对血小板进行染色,发现有些血小板胞浆内有粗糙的呈点状分布的网状物质,他们认为这些物质只是胞浆中残留的mRNA物质被染料着色,因而将这些血小板称为网织血小板。 1990年Kienast等报道利用流式细胞仪检测RP,用荧光染料噻唑橙标记RNA进行分析测定,方法与网织红细胞的FCM测定相似。但由于仪器昂贵,步骤繁琐,没能在临床常规采用。近年来,sysmex生产的XE-2100 增添了网织血小板检测功能,仅使用少量末梢血,瞬时即可得到红细胞、血小板及血小板多项参数。 Rp也与网织红细胞一样都是刚从骨髓中释放出来的未成熟细胞,它与正常血小板相比胞浆内含有少量的mRNA,体积较大,而且有更强的活性,随着血小板的成熟,mRNA逐渐消失,体积逐渐缩小,RP能够比较精确地反映骨髓血小板生成情况,对于血小板方面疾病的诊断和治疗判断具有很好的临床意义:①利用RP%和RP绝对计数结合外周血血小板计数用于血小板减少性疾病的鉴别诊断和治疗效果的监测;②通过RP%和RP绝对计数,用于血小板增生性疾病的鉴别诊断和发生栓塞危险性的判断。

众所周知,细胞周期由G1期、S期、G2期和M期所构成的。各期细胞的DNA含量如下:G1期为2C,G2期和M期为4C,S期则在2C到4C之间。所以在FCM的DNA直方图上形成的谱线则为峰分布,而且G1峰的道数恰好是G2和M峰道数的一半。研究表明:对于正常细胞群,各周期时相的细胞数的比例是同一的;对于恶性病变的细胞群则是非均一的。

1.3结果判定

6 外周血与脐血造血于/祖细胞分选与成份鉴定 近年来,外周血造血干/祖细胞移植已在国内外蓬勃发展,并已取得较满意效果。不论是异基因或同基因移植,还是研究利用脐血,为保证尽早达到造血重建和持久的植活,必须有足够数量的干细胞和各期祖细胞。因此,FCM检测CD34+细胞亚类是必不可少的步骤。一般CD34,CD38,HLA-DR,CD33,CD41等组合的双标记法,也只有FCM法能提供最快的信息和最可靠的数据。FCM可从杂合细胞群体中分选出感兴趣的细胞。由于CD34+细胞在骨髓中仅占1%~3%,在外周血中比例更低,分选既耗时又影响纯度。如果选用免疫磁珠加FCM分选则可达到98%~99%以上的纯度,并保留细胞活性。总之,FCM经过多年得完善和发展,已由最初的研究应用技术逐渐进入临床应用领域,为疾病诊断提供更为科学的诊断依据。

图10-7 细胞周期的DNA直方图

1.3.1DNA指数表示DNA倍体水平DI=测定细胞(G0/G1峰均道值)/内标细胞(G0/G1峰均道值)×2.85

图10-8 细胞周期中的细胞数目与肿瘤的关系

本实验内标细胞为鸡红细胞,测定二倍体的鸡红细胞DNA含量为正常人淋巴细胞含量的35%,故乘常数2.85。依据DI值判定DNA倍体,本组资料以DI=0.9~1.10为二倍体及近二倍体,其它为异倍体。

临床肿瘤病学已经注意到细胞动力学的重要性。研究工作表明:肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感程度与细胞的增生率高低密切相关;采取细胞同步化措施可以提高疗效。例如可以使用雌激素这种外源性药物让雌激素受体阳性的乳腺癌细胞同步化。

1.3.2细胞周期细胞周期由计算机确定G0/G1期、S期、M/G2期三期细胞的道数范围后,将落在各自道次上的细胞数叠加总合而得。增殖细胞指数PI=[/(G0/G1+M/G2+S)]×100%。

临床微生物学可以用FCM对大量细菌的DNA和RNA含量进行测量,进行微生物鉴定、医学常规中的细菌抗生素敏感试验和传染活性的测定。

1.4统计学方法

FCM优良的分析和分选功能在分子遗传学领域也能充分发挥。例如流式细胞核型分析技术就是用FCM对染色体进行分类、纯化,检测或定量测量细胞表面或内部由特异基本所编码的成份。这方面的成果已用在畜类性别的预选择,以及对人类计划生育等方面的工作。

所得数据均值比较用t检验,百分率比较用χ2检验,以P<0.05为显著水平。

2.在免疫学方面的应用 FCM以它的快速、灵活及定量的特点被广泛地应用于免疫学的基础研究和临床应用的各个方面,尤其是结合单克隆抗体技术,在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监测、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面更能起到重要作用,成为现代免疫技术的重要组成部分。基于免疫技术是免疫细胞化学分析技术的基础,我们着重介绍FCM在免疫应用中的技术问题。

2 结果

免疫应用的激发光源和滤片系统:适用于免疫技术的FCM的激发光是氪离子气体激光器,光谱中波长为531nm和856nm的谱线最强。为了扩大仪器对双标记或三标记染色的荧光信号的分辨范围可使用双激光光源。

2.1滑膜肉瘤DNA含量

为了减少细胞由于激光束造成的散射光对光电倍增管的影响,要使用贴有干涉膜的滤片系统。为了同时测定两种波长以上的荧光信号,光路中还要使用二向性分光元件。

表1 单相型、双相型滑膜肉瘤的DI期、S期、PI比较

为了测定伴随细胞转化过程所产生的早期免疫及生化性质的改变,例如膜的流行性,DNA构象变化等,可以使用偏振片。

例数 DI值 异倍体比例

总之,应用于免疫学时要充分考虑有关光源及光学滤片系统的正确使用。

Ⅲa 6 1.08±0.04 50

免疫应用的荧光染料及染色:免疫应用中的荧光染料主要有FITC、TRITC、PE及其组合。在进行多种标记时特别要注意结合抗体的每种色素都不干扰抗体反应的特异性,也不相互干扰。

Ⅲb33 1.29±0.09 15.2

免疫荧光染色有直接法和间接法二类:

Ⅲc 7 1.60±0.08 100

①直接染色法

Ⅳa 6 1.89±0.10 100

1)取约106的细胞置于尖底离心管内,管内液体要少些。加荧光标记抗体,在4℃温度下静置15~30min。若作双标记染色也可直接加入。

2.2DNA含量与滑膜肉瘤分期及病理类型的关系

2)用冷的10%的小牛血清、0.1%的叠氮钠溶液,1/15mol/L的PBS离心清洗细胞2次。1000rpm离心5min或4000rpm离心1min。

52例滑膜肉瘤各期异倍体的比例分别为Ⅲa50%、Ⅲb15.2%、Ⅲc100%及Ⅳa100%,异倍体的出现机率并不随着肿瘤分期的进展而增加,但晚期滑膜肉瘤异倍体检出率为100%。52例滑膜肉瘤中单相型和双相型分别为33例和19例,单相型占本组资料63.4%,其中单相型滑膜肉瘤DI指数、S期道数及增殖细胞指数均较双相型高,且二者差异显著(P<0.05),说明单相型肿瘤细胞具有更高的增殖率。

3)加入适量缓冲液待测。

表2 52例滑膜肉瘤各期异倍体的比例及DI值

②间接染色法:

单相型 双相型 P值

1)取106细胞加特异的第一抗体,4℃温度下静置15~30min。

DI 1.64±0.241.24±0.02 <0.05

2)加缓冲液离心清洗2次后,吸尽残留液体,弹散沉淀,加入荧光标记的第二抗体,4℃静置30 min。

S27.69±3.114.46±1 .82 <0.05

3)缓冲液离心清洗2次后加入适量缓冲液待测。为减少无关因素干扰,操作尽量在水浴中进行。

PI42.21±6.40 29.76±4.18 <0.05

染色中应注意的事项:①细胞标本在整个过程中要尽量保持新鲜,采用有效措施防止表面抗原消失和细胞死亡;②荧光标记物用前应用滤膜或高速离心去除颗粒或沉渣以减少非特异性干扰;③细胞标本染色前应除死细胞;④为提高灵敏度可用三步间接染色法。

3 讨论

免疫荧光标本的特殊处理:

80年代以来迅速发展起来的流式细胞技术已成为判断人类恶性肿瘤预后的标准,研究表明肿瘤细胞DNA倍体水平与肿瘤的分化、生长方式、淋巴转移及肿瘤患者的预后密切相关,且恶性程度高的肿瘤DNA非整倍体的检出率也高[4]。由于各家使用不同型号的流式细胞仪和不同的标准细胞,DNA组方图差异甚大,以G0/G1峰的DI值更能说明细胞的DNA含量,同时便于数据的相互比较及处理[5]。

①死细胞及碎片去除:样品中不可避免地存在着死细胞及碎片,影响分析结果。对于血细胞可用FCM通过0。散射的差异不经染色而将死细胞分出弃除;对于培养细胞,由于其大小分布不均,可在样品内加少量PI染色后将死细胞去掉。一般情况下即可用仪器直接去除碎片,也可用血清沉降法去除大碎片,用离法去除小碎片。

本组资料表明,单相型滑膜肉瘤在滑膜肉瘤占有较高的比例,且单相型滑膜肉瘤有较高的S期及M/G2期比例及较高的肺转移率,预后较差。作者认为对滑膜肉瘤患者应积极采取根治手术,术后配合应用S期特异性药物杀伤残存的肿瘤干细胞,防止肿瘤细胞继续增殖及转移,可望提高滑膜肉瘤的生存率。

②标本的保存和固定:实验中大多数样品在染色或分析前需要保存一定的时间,有时甚至需要进行固定。

未染色的新鲜标本贮存方法如下:10%二甲基亚砜,90%小牛血清,5×106~1×107细胞在-70℃过夜,然后置液氮中可长期保存。

免疫染色未经固定的标本在4℃可保存48h。若需存放时间较长、或标本具有传染性,应该用固定剂固定。常用的固定剂配方是:1%~4%的多聚甲醛和PBS或0.8%的生理盐水配成p H7.2的固定液;或用0.37%~1.5%甲醛和PBS配成p H7.4的固定液。固定方法是:将经免疫荧光染色的细胞离心沉淀,再加入固定液混匀,放在4℃温度保存。一般来说,经固定处理的标本保存1周至2个月,多数样品的阳性细胞群体比例及荧光强度增色能保持在正常范围之内。

主要检测的免疫指标:

①细胞毒试验:细胞毒是机体的一种免疫监督机制,细胞毒实验是一项重要的免疫指标。例如天然杀伤细胞NK是一种引起免疫媒介的效应物,在抗肿瘤及感染因子的免疫监督系统中起着重要作用。研究表明,对NK细胞的测量可以做为免疫治疗监测的重要参数和有效的预后征状的指标。所使用的荧光探针为CFDA。

②吞噬功能实验:单核吞噬细胞系统是机体的主要防御系统之一。FCM可以快速、定量地检查吞噬细胞的吞噬能力和速度。

③I型变变态反应的IgE受体细胞、IgE结合因子的检查。

④胞浆Ig及血清Ig分析,血小板表面的IgG测定,等等。

3.在临床方面的应用FCM在临床诊断、疗效评价和预后预测等方面都发挥了一定的作用。工作做得较多的主要在肿瘤学、血液病学等。这些都和FCM在荧光细胞化学中的直接应用有关。

癌前病变的检测和预后评价:有效地发现癌前病变而给予阻断治疗,无疑是肿瘤防治的重要环节 。FCM的探测对象主要是癌前细胞,即那些处于正常细胞向癌细胞转化的量变阶段、尚未达到质变的细胞。研究表明,除心肌、肝组织及精子细胞外,人类正常的体细胞都具有恒定的DNA二倍体含量,而那些癌前细胞和癌细胞则在其发生发展过程中伴有DNA含量变化异常。另在资料表明:癌前病变向癌变的转化发生率与细胞的不典型增生程度有关,而细胞的不典型增生程度又与DNA含量的异常改变呈平行关系。利用FCM可以定量地测出癌前细胞的DNA含量并根据DNA分布直方图直观地反映出细胞的周期分布状态,从而了解到癌前细胞增殖能力变化的动态过程,这样便可以获得一些从组织形态学中难以得到的信息。

表10-1 是以胃粘膜为例比较正常细胞和胃癌细胞在DNA含量及细胞周期分布方面的差异。

表10-1 正常与胃癌的胃粘膜细胞DNA含量方面的差异

二倍体DNA含量细胞周期分布非整倍体G0/G1S期G2/M期 正常细胞100088.9±1.25.0±0.63.4±0.7胃癌患者细胞010077.3±1.810.9±1.17.4±0.7

从表中看出差异是显著的。我国一些学者也提出有关FCM诊断癌肿细胞的细胞标准,并已付之临床应用。

目前,对于癌症病人预后评估的主要依据是病理组织学分级和临床分期等指标,不少人已认识到用FCM来检测DNA是对肿瘤预后评价的一个较为客观有效的指标。总的倾向是:异倍体的出现是恶性肿瘤的一个标志;异倍体肿瘤的恶性程度高、复发率高、转移率高及死亡率高;二倍体及近二倍体肿瘤预后较好。

在临床血液学方面的应用目前也以血液系统的肿瘤诊断、分型和预后关系等方面的应用为主;其主要技术途径也是基于对DNA倍体分析和细胞增殖周期的分析。限于篇幅不再多叙。有关的技术细节 将在下节 以FCM在外周血白细胞的免疫组织化学分析方面的应用为例详加介绍。

DNA指数:由于DNA的非整倍体细胞是肿瘤的特异性标志已经得到肿瘤学界的公认,在些学者提出建议采用流式细胞术DNA分级指数表示DNA含量的异常程度。根据1984年国际分析细胞学会名词审定委员会的规定:

一般样品应采用同种或同个体的正常细胞为标准二倍体细胞。在血液学研究中通常以正常人外周血淋巴细胞作为标准二倍体细胞。需要指出的是,在报告DNA的测定结果时必需包括G0/G1峰的变异和系数,即C.V值,若有多个DNA干系则要给出各个G0/G1峰的C.V值。用于肿瘤临床诊断的总体依据是:a.正常二倍体的DI=1.0,判断为阴性;b.出现二个或多个可以分辨的G0/G1峰则可判断为阳性;c.虽无明显的G0/G1峰的分化现象,但峰的C.V值较大,则可根据DI数个及其它有鉴别意义的征状给出参考性的诊断。

以上我们主要从FCM在生物医学工程学领域应用的基本原理和技术途径介绍了和组织化学有关的内容,至于一些技术细节 则在下节 做较为详细的说明。

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