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胃肠道粘膜T淋巴细胞,胃肠道粘膜免疫细胞化学特点

胃肠道与外界相通,其粘膜表面附着各种细菌和病毒。粘膜含有各种组织溶解酶,而且胃粘膜呈酸性,肠粘膜偏碱性,因此在进行免疫细胞化学染色过程中,必须注意以下几个环节 :

癌胚抗原是分子量约20万的糖蛋白,具有二级以上结构。不同肿瘤中提取的CEA虽然抗原性相似,但所含唾液酸及其它糖组分的含量不一定相同,故有多个抗原决定簇,能与非特异性反应抗原NCA、NCA-2和正常胎儿粪抗原等发生交叉反应。NCA存在于正常肺、胰腺、粒细胞、单核细胞及巨噬细胞内,也存在于正常肠粘膜、胃粘膜肠化生腺体细胞及胆汁内。临床血清学检查CEA对结肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌及其它腺上皮性恶性肿瘤等的诊断有较大价值。免疫细胞化学研究可以明确CEA的定位和分布,也可以通过组织切片和分泌物涂片进行临床诊断和鉴别诊断。

根据标记物的不同,免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术,免疫酶细胞化学技术,免疫铁蛋白技术,免疫金-银细胞化学技术,亲和免疫细胞化学技术,免疫电子显微镜技术等。近些年来,核酸分子原位杂交技术采用生物素、地高辛等非放射性物质标记探针,和免疫细胞化学技术密切结合,发展为杂交免疫细胞化学技术。不同的免疫细胞化学技术,各具有独特的试剂和方法,但其基本技术方法是相似的,都包括抗休的制备,组织材料的处理、免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。还有双重和多重标记技术也有重要的用途。

胃肠道T淋巴细胞分布在上皮层、固有层、粘膜集合和散在淋巴滤泡及肠系膜淋巴结内。随着免疫细胞化学技术广泛应用和各类T细胞亚群单克隆抗体的制备成功,为进一步研究不同部位T淋巴细胞的分类和功能起极其重要的作用。

一、抗原的稳定性

二、癌胚抗原的免疫细胞化学染色

一、抗体的制备和配制

1.上皮内T淋巴细胞上皮内淋巴细胞是指位于上皮层基底部的T淋巴细胞。近年来,对IEL对邻近上皮细胞有压迹,位于两个上皮细胞交界处,并未进入上皮细胞内。近年来,对IEL研究非常深入。已经证实75%以上成人小肠IEL是TCRγαβ阳性细胞,说明它们来源于胸腺,接受过抗原刺激。其中大部分为诱导、杀伤性T淋巴细胞,10%左右为CD7阳性和CD3阴性的IEL,类似NK细胞,有细胞毒作用,但无NK细胞标记,对NK的靶细胞无破坏作用。10%~20%左右为TCRδ阳性IEL,不受胸腺的影响,其中70%CD4和CD8均阴性,为T淋巴细胞前体。说明人的部分IEL通过胸腺外途径进行分化。内毒素等腔内抗原与肠上皮细胞微绒毛、肠腺隐窝细胞、巨噬细胞和树突状细胞膜上的组织相关性抗原分子相结合后,将抗原分子传递到CD3阳性T淋巴细胞受体中的α和β亚单位可变区进行结合,在CD8分子作用下导致IEL增殖和分泌大量γ-干扰素,α-肿瘤坏死因子,和少量的白介素-2,发挥细胞毒性作用,调节 上皮细胞再生和增强对食物抗原的耐受。

免疫细胞化学和组织化学就是检查、鉴定、定位和示踪组织中各种抗原成分。在组织加工过程中,必须保持抗原的形态、结构、抗原性和在组织中的位置保持不变,不引起组织产生自发荧光及其它非特异性着色。原则上越新鲜的组织越适于进行免疫细胞化学和免疫组织化学研究。

1.组织加工有人提出用冰冻切片进行CEA免疫细胞化学染色。由于非特异性荧光和需要一定设备条件,有人改用福尔马林固定和胰酶消化的方法。从我们的体会看,福尔马林固定后的切片CEA的部分抗原决定簇被遮盖,阳性结果显着受到影响。但是用冷酒精固定后的组织切片,CEA的阳性率明显升高,而且结果仍很清晰。goldenbery等同时进行CEA酶标记组织,而福尔马林固定的组织切片中CEA检出范围为3.0~7.0ng/g组织,酒精固定的组织切片比福尔马林固定者敏感2~3倍。有趣的是我们用酒精固定26个月的切片进行染色,效果仍然很好。说明冷酒精固定法便于进行回顾性研究。虽然酒精固定后组织收缩比较明显,但不影响组织结构及形态,而且可以进行多种抗原的定位研究,操作简单,是值得推荐的一种组织固定方法。冷酒精固定方法和步骤同抗体产生细胞的研究。

抗体的制备

2.固有层T淋巴细胞固有层T淋巴细胞分散在固有层,约占固有层免疫细胞总数10%左右。其中CD4阳性细胞显著多于CD8阳性细胞。40%CD4LPL表达CD45RO抗原,能产生大量IL-2、IL-4和γ-INF,为记忆性T淋巴细胞,能辅助B细胞转化成抗体产生细胞并促其分泌抗体。60%CD4LPL表达CD45RA和CD8抗原,能直接抑制抗体产生细胞转化和分泌。这两种细胞的比例在调节 抗体分泌中起着重要作用。CD8LPL也可以分两种:一种表达CD28抗原的LPL,能通过ADCC或直接溶解靶细胞。另一种表达CD16抗原,具有自然杀伤功能。LPL能被IL-2激活,激活的LPL能释放大量IL-2、IL-4、γ-INF和IL-5、IL-2又能激活LPL,起着自身分泌作用。IL-5能促进抗体产生细胞分泌抗体。

1.组织切片标本经胃镜、小肠镜和大肠镜等内窥镜取材可以在直视下根据研究的内容在不同部位进行取材,即准确又方便。一般组织块直径多在0.5~1.0mm左右,适合进行各种抗原的研究。

2.染色方法的选择根据实验条件和抗体特点选择染色方法。PAP和ABC技术可以采用,但试剂价格较昂贵,步骤较复杂。我们认为间接荧光或间接酶技术即可获得满意结果。间接酶染色技术步骤如下:

这是免疫细胞化学技术的首要试剂,必需制备具有很高特异性和敏感性的高效价抗体,这将在本书第二章 中详述。目前国内外市场各种特异性抗体日益增多,许多实验室直接应用市售产品,现在我国自制抗体种类少,发展抗体生产十分必要。尤其要定位一种新的抗原物质,能够自制较好。

3.胃肠道相关淋巴组织T淋巴细胞胃肠道相关淋巴样组织主要包括肠系膜淋巴结和粘膜中集合和散在淋巴滤泡。GALTT淋巴细胞多们于生发中心的外周部位,约占40%。其中CD8和CD4阳细胞比例与周围血相似。动物研究证明,肠系膜淋巴结内的CD4阳民生细胞多于固有层。分子生物学研究发现GALTT淋巴细胞含有IL-4和IL-5基因,激活后产生大量IL-4和IL-5,能特异性增加B和T淋巴细胞增殖。抑制B淋巴细胞分化。其表面糖蛋白主要为CD45RA和leu8(CD8),证明是幼稚T淋巴细胞。它们对抗原刺激的增殖反应低,对刀豆素A等有丝分裂促进剂的增殖反应高,产生IL-2和γ-INF低,辅助作用弱。GALTT淋巴细胞如何调节 B淋巴细胞转化成IgA产生细胞和其它免疫细胞的增殖及功能,并不十分清楚。有待进一步研究。

取材方法:将取材部位调整到内窥镜视野中央,使活检钳与粘膜面垂直,然后钳取。活检钳应尽量下压深取达粘膜全层。取出活检钳并打开活检器时要轻,防止粘膜撕裂。立即将活检组织轻轻在粘在滤纸上,并尽量使粘膜面与滤纸平行。

冷酒精固定的组织石蜡包埋,组织切片,常规脱蜡后在PBS中放置5min,过一次蒸馏水清除玻片上的沉淀物后风干,加含3%H2O2甲醇一滴在切片上,放置20min后再PBS冲洗3次,过蒸馏水后风干。

抗体的配制

近年研究发现,除M细胞和巨噬细胞外,胃肠上皮细胞在接受和传递抗原中也起重要作用。免疫细胞化学发现正常小肠上皮细胞微绒毛和侧膜有斑片状MHc II类抗原,人小肠为HLA-DR糖蛋白,能识别、加工和传递抗原使粘膜内T淋巴细胞产生免疫反应。HLA-DR表达受γ-IFN诱导。因此免疫反应中组织相关性抗原与IEL和LPL淋巴细胞互相进行调节 。

组织固定:根据所查抗原的种类采取相应的固定方法。我们的体会是:对某些蛋白类抗原,如免疫球蛋白、SC、CEA等一般用95%冷酒精固定较好。95%乙醇不但能固定蛋白抗原,而且保持与抗体的免疫反应能力,同样可以进行HE染色。除组织有部分收缩外,组织成分和抗原位置没有大的改变,组织块可以在冰箱内长期保存。我们对保存26个月的冷酒精固定组织进行CEA和SC的研究,效果仍很好。对多肽类激素的研究可以用4%多聚甲醛缓冲淮,Bouin 缓冲液或福尔马林缓冲液进行固定,或直接液氮固定后冷冻切片。冷酒精固定的组织不宜进行多肽类激素的研究。对陈旧性福尔马林的固定的组织可以在抗原表面形成蛋白衣,直接影响抗原抗体反应。有人用胰酶消化后暴露抗原部位,进行胃泌素细胞的免疫细胞化学染色,也获得较好结果。要进行胃肠道多肽类神经的免疫组化研究,可用含Triton的固定液和冰冻切片。对小白鼠等动物可向血管内注射多聚甲醛等固定剂,然后处死取材。进行细胞膜抗原的单克隆抗体研究时最好用Cryostat冰冻切片,然后丙酮或乙醇固定10min左右。

加稀释好的兔抗CEA血清在37℃湿盒内放置45min。

包括抗体贮存液和抗体使用液的配制方法。新制备或购进的是原液或冻干品,抗血清为全血清,单克隆抗体是培养上清液或腹水。

二、研究方法

组织加工:温度对抗原抗体均有影响。一般在4℃进行脱水和透明。包埋选用低熔点蜡,浸蜡时间以20min左右为宜。脱蜡和脱二甲苯也应在低温下进行。

PBS清洗3次后风干,再加HRP标记物的羊抗兔IgG,37℃湿盒内放置45min。

1.抗体贮存获得新抗体后,应先根据生产厂家提供的抗体效价,将其分装,可每10μl或100μl/支分装入安瓿或0.25ml带盖塑料管中,密封。放入-20。C~40。C冰箱中保存备用,一般可保存1~2年。小量分装的抗体可1次用完,避免反复冻融而影响效价的降低。一般用前新鲜配制使用液体,稀释的抗体不能长时间保存,在4。C可存入1~3天,超过7天效价显著降低。

1.组织切片中T淋巴细胞80年代以前多用玫瑰花瓣试验和酸性酯酶方法进行组织切片中T淋巴细胞研究,特异性较差。近年来多用OKT,Leu或CD等系列T淋巴细胞单克隆抗体进行研究,特异性高,可以分类出各种亚群。免疫组化染色中应注意以下几个方面:

组织保存及切片:石蜡包埋或其它方法加工后最好立即进行切片和免疫细胞化学染色。根据不同的抗原也可以在低温下保存一段时间后再染色。组织切片的免疫细胞化学染色实际上使切面的抗原暴露后直接与抗体相结合,一般组织切片厚度以5~7μm为宜。如果观察神经纤维则以10~20μm为好。太厚则透射光不易通过,影响观察,易出现自发荧光。如果进行免疫电镜观察,最好超薄切片。

PBS清洗3次后加新鲜配制的含3%H2O2pH7.6Tris缓冲液中暗处反应5~8min,自来水冲洗,用1%甲基绿复染2~5min,再次自来水冲洗,常规脱水、透明和封片,在光镜下观察。

2.抗体使用液的配制这是任何免疫细胞化学方法中最重要的一环,无论是一抗、二抗和各种标记抗体,用前都必须按不同免疫染色方法和抗原性强弱与抗原的多少,稀释使用的各种抗体原液,以便获得最佳免疫染色结果。

抗体的选择:根据不同目的选择相应的抗体,如要对人胃肠道组织进行研究,可选用OKT系统单抗;对鼠类等进行研究可选用Leu 或Thy系列。如要研究辅助性T淋巴细胞可用OKT4或CD4;研究抑制性T淋巴细胞可用OKT8或CD8等单克隆抗体。

2.涂片或印片标本拉网和内窥镜下获得的胃肠道分泌物等可直接涂片,空气干燥,再用乙醇固定后进行免疫细胞化学染色。涂片和印片缺乏明确的组织结构,标本中常常混有不同形态的组织细胞和其它蛋白等无定形成份,很容易造成假阳性,观察时应当特别注意。

3.阳性结果判断及计数检查前应当对CEA的分布有一定理性认识,而且用正常结肠组织和阳性组织作对照观察。CEA以三种形式出现在胃肠道组织切片中:①腔面分布。沿腺腔面的胞浆有棕红色酶着色。这是胃粘膜中肠上皮化生腺体、高分化腺癌和正常结肠腺体的CEA分布形式。②胞浆分布。在低分化粘液细胞癌中,CEA多位于胞浆。③粘液分布。在高分化腺癌的腺腔和粘液细胞癌周围的粘液中有CEA着色。

抗体最佳稀释度的测定方法:用已知阳性抗原切片,进行免疫染色,将其阳性强度与背景染色强度以“+”表示,可分为++++、+++、++、+、。++++为最强阳性,+++为强阳性,++为较强阳性,+为弱阳性,为阴性。

组织加工方法选择:目前所研究的特异性T淋巴细胞抗原决定簇多位于细胞膜上,用陈旧或普通组织固定和加工方法可能使抗原破坏,应采用新鲜组织和低温处理。具体方法是:手术或活检获得的组织立即用液氮冷冻,或用OCT复合物包埋后再放入液氮中,便于切片,Cryostat冰冻切片后室温下风干,用4℃纯乙醇或丙酮固定10min,PBS冲洗后即可进行免疫细胞化学染色。

3.组织分离细胞将手术或活检组织块用机械研磨或胶原酶消化等方面可分离出细胞,加入培养基,在试管内进行活细胞免疫荧光或免疫酶等免疫细胞化学染色。流式细胞仪进行定量和定性分析。此法对细胞膜抗原的研究有较大价值。我们在试管内用免疫荧光技术对周围血分离的单核样细胞进行T淋巴细胞亚群和B淋巴细胞的研究中,发现OKT3、OKT4、OKT8和Ia的荧光均分布于细胞膜,随着细胞的滚动,犹如火球,非常清晰。

4.腹水免疫细胞化学染色临床上鉴别良恶性腹水可采用免疫细胞化学技术。抽取200~300ml腹水,离心后取细胞沉淀进行直接涂片、干燥、酒精固定后采用间接荧光染色。具体的方法是:在腹水涂片上加兔抗CEA抗血清,在37℃湿盒内放置45min后BPS冲洗,共10min,再加入FITC标记的羊抗兔IgG,在37℃湿盒内放置45min后,PBS冲洗3次,共10min,用50%甘油封片,荧光显微镜观察。有绿色荧光阳性细胞的片子再进行HE染色,做对照观察和判断。也可以将细胞沉淀物在试管内直接进行间接荧光染色。我们发现,不论采用哪种方法,都可能出现非特异性着色。少数淋巴细胞也能出现荧光或酶着色。其机理尚不清楚,如果采用伊文氏蓝作对比荧光染色,可明显减少非特异性荧光,而且淋巴细胞较小,腺癌细胞较大,有利于进行鉴别诊断。

①直接测定法:用于测定第一抗体的最佳稀释度,其它条件稳定可靠。将一抗稀释为1:50、1:100、1:2001:400、1:500等5个稀释度滴加在阳性抗原切片上,同时设一替代和阴性对照,结果如表1-1:

染色方法的选择:因抗原较微量,而且位于细胞膜,应采取敏感性强、特异性高、非特异性着色少的方法。虽然有报道采用间接荧光或间接酶标技术也能显示特异性T淋巴细胞,我们推荐最好采用PAP或ABC染色技术。具体方法参阅第三,四章 。

二、抗体的特异性

三、临床意义

表 1-1 选择最佳稀释抗血清方法

2.粘膜分离液中T淋巴细胞一定重量粘膜组织中分离出来的T淋巴细胞也可以用免疫细胞化学进行定量和定性研究。下面介绍用间接免疫荧光技术研究IEL的大致过程:

示踪抗原的抗体必须具有高度特异性,尽量减少非特异性染色和干扰。因此染色前必须测定抗体的工作效价,并用严格的阳性对照。组织切片应当有连续切片的HE染色作对照。

免疫细胞化学技术可以确定CEA的组织发生部位,根据阳性特点可以判断癌细胞的位置。我们的研究发现正常结肠组织CEA为弱阳性,多非常清晰分布在腔面。但结肠癌组织中CEA着色带较宽,多为强阳性,而且不规整。对胃粘膜的研究发现正常胃腺体均为阴性,肠化生腺体细胞弱阳性。胃腺瘤细胞也含有CEA。70%以上胃癌细胞CEA强阳性,特别是粘液细胞癌,光镜下癌细胞分散浸润,无法确定其转移及浸润范围。用免疫荧光或免疫酶技术进行染色,根据阳性细胞分布可作出正确判断。在肝脏或其它部位转移癌有时因细胞分化不良,无法确定其组织来源。如果用免疫细胞化学染色,发现CEA阳性细胞说明来源于腺上皮的癌肿,可能来自胃肠道或卵巢等组织。用胸腹水进行免疫细胞化学染色对临床诊断有实用价值。Walts对26例肿瘤病人渗出液和抽吸液离心后做免疫酶染色,发现13例有CEA阳性细胞。11例常规细胞学检查阴性的肿瘤病人发现8例胸腹水中有CEA阳性细胞。如果胆高CEA抗体的特异性,改进组织加工方法,排除非特异性着色,可望提高诊断价值。已经有人在血清学监测CEA诊断胃肠道肿瘤的基础上,将CEA标记125I进行放射扫描定位诊断和用CEA标记131I或抗癌药物进行肿瘤治疗的报道。

一抗稀释度特异性染色强度非特异性背景染色度1:50++++++1:100++++++1:200++++++1:400++++1:500++阴性对照

将手术取得的肠管纵形剪开,将上皮层与固有层分离。

三、染色技术的选择性

从表中结果可见,第一抗体稀释到1:400时阳性结果呈强阳性,背景染色减少,其最佳稀释度在1:400~500之间。再作1:420、1:440、1:460、1:480、1:500稀释后染色,找出最佳稀释度。

上皮层放在无镁离子、含100U青霉素和链霉素及0.2%叠氮纳的PB中清洗,无血液和其它杂质后用解剖剪将组织剪碎,用匀浆器磨碎或用超声粉碎或用胶原酶溶解上皮细胞。

应当根据设备条件,具备的抗体和示踪抗原的特点进行选择。我们的经验是:因胞浆性抗原含量较多,可以用简便和廉价的间接法甚至直接法免疫细胞化学染色;对膜抗原及其它一些微量抗原应当选用PAP或ABC法,如果同时进行两种以上抗原的检查,最好进行双标记和多标记免疫细胞化学染色;为了显示较弱的抗原,可以用对比染色技术,背景为另一种颜色,使阳性抗原着色更突出。

②棋盘测定方法:当测定两种以上抗体的最佳配合稀释度时,必须采用此法。

匀浆液通过脱脂棉、尼龙筛或金属网获得淋巴细胞悬液。

四、结果的可比性

表1-2 两种以上抗体最佳配合稀释度选择表

将硅化玻璃球高压消毒,冲洗和平衡后将悬浮液过柱,得到的细胞液直接计数。也可以用淋巴细胞分离液提取,用台盼蓝测定其活性,并加10%FCS-RPMI细胞培养液,淋巴细胞数应达5×106/ml。

1.如研究胃粘膜中抗体产生细胞应当掌握在HE染色时的车轮状核位于胞浆一侧,胞浆特别丰富,染色时仅胞浆着色而核不着色等特点。同时应了解所研究的抗原在组织中的大致定位及分布规律。如分泌5-羟色胺的内分泌细胞多位于固有层间质内,VIP和SP分布在固有层神经末梢及粘膜下层的神经元,胃泌素细胞分布胃肠腺体细胞之间。CEA多分布在腺癌细胞,如果在固有层内出现阳性细胞,要谨慎对待,必须排除污染、内源酶或自发荧光,同时与连续切片的HE染色切片对比观察才能作出判断。

第二抗体第 一 抗 体1:5001:10001:20001:40001:100++++++++++++1:200+++++++++++1:400+++--

试管内加0.1ml细胞液后加OKT系列单抗0.1ml,同时用另一试管加0.1mlPBS作对照。混合液在4℃放置30~60min后,PBS冲洗3次,离心后细胞沉淀物再加PBS至0.1ml。

2.阳性结果的定量分析免疫细胞化学和免疫组织化学染色受到的影响因素较多,最好在相同组织加工方面、统一批号抗血清和标记抗体、统一染色技术和结果判定方法,同时对病态和正常组织进行对照观察才能增加可比性。用免疫组织化学进行抗原定量分析时,可根据着色程度,选用某一基点为标准进行半定量计数,但容易受主观因素的影响。近年来,数字减影技术的应用,大大提高了定量研究的准确性。对阳性细胞的计数,多采取以下几种方法:

括号内为背景染色结果

加0.1mlFITC标记的抗鼠IgG,4℃放置20~30min,PBS洗3次,离心后加在红细胞计数板上,荧光显微镜观察。

直接计数法:以10~20个随意选择的高倍视野直接进行阳性细胞计数,或计算100~200个总细胞中阳性细胞的数量。由于阳性细胞分布的不均匀性,可能存在一定误差。

从表中可见第一抗体1:1000,第二抗体1:2000接近最佳稀释度,再将一 抗体作1:600、1:700、1:800、1:900和1:1000稀释,即可找出最佳稀释度。

阳性细胞为细胞膜上有绿色荧光,有的呈颗粒样,随细胞滚动。荧光镜下可计算200个淋巴细胞中阳性细胞所占的百分率,或根据血细胞计数板中阳性细胞算出细胞总数及百分率。

体积计数法:测定单位面积内的细胞数,再算出每立方毫米体积内阳性细胞总数。一般组织切片只有5~7μm厚,与1mm厚度组织切片的细胞密度不可能完全一致。

抗体稀释液的配制:常用0.01mol/l pH7.4PBS或TBS缓冲液作抗体稀释液。可用以下方法配制专用的抗体稀释液,防止抗体效价下降,减少抗体在组织上的非特异性吸附:取0.05mol/l pH7.4 TBS100ml,加温到60。C,再加入优质明胶100mg,搅拌溶解后,冷却至室温,加入1g牛血清白蛋白,加入NaN3200mg溶解后,过滤,分装,4。C保存。

三、临床意义

细胞密度计数法:即计算单位粘膜面积的阳性细胞数。有人提出以0.5mm宽,粘膜切面会层作为一个单位。因内窥镜取材时,组织块不规则,显微镜下要具体选择有一定困难,。我们用改良的Dellesses公式进行计算比较方便。原公式NV=N×109,NV代表每立方毫米体积细胞数;N代表细胞总数,r为测微器小方格边长;∑为切片厚度;P为小方格数。我们只计算每平方毫米面积细胞数,即D=N/。方和边长为0.5mm的测微器放在目镜下,物镜放大4倍,即用测微器去量放大4倍的物体,测出的边长必须缩小4倍才是物体的真正面积,已知r为0.5mm,将上述数据代入公式,得D=N2=16N/(Pr2)=16N/(P(0.5)2)=64N/P。只要计算整个组织切片的细胞数和所占小方格数,即可得出阳性细胞密度。组织分离细胞可通过流式细胞仪进行计数。

抗体的最佳稀释度由于各种抗体的效价不同,组织中抗原强弱不一,应根据不同情况作适当的调整,以取得中等阳性稀释度为佳,因其既适合于抗原性强和含量多的标本,也可用于抗原性弱的标本。

1.IEL在胃肠道粘膜中起重要免疫屏障作用正常成人空肠100个上皮细胞有20个IEL,回肠有13个,结肠只有5个,这也可能是恶性肿瘤不发生在小肠的重要因素之一。我们发现胃粘膜也有IEL。在胃部炎症和溃疡时,上皮及腺体隐窝细胞间的IEL明显增加。IEL不但参与免疫反应,而且通过伪足与上皮细胞接触,加速上皮细胞再生。电镜下胃粘膜也发现这种现象。IEL与乳糜泻关系最密切。近期研究表明,第12型腺病毒与麦胶蛋白有同源性。CD病人肠道感染这种病毒后,服用麦胶数小时粘膜中IEL显著增加。在上皮细胞HLAII抗原糖蛋白分子作用下与TCR结合,激活TCRαβlEL,发挥细胞毒作用,导致肠粘膜萎缩,引起脂肪吸收不良和腹泻等一系列临床症状。增加的TCRγδIEL调节 TCRαβ的杀伤作用。停服含麦胶食物后,TCRαβIEL明显减少,上皮细胞再生恢复,临床症状消失。CD病人出现疣状胃炎也是IEL参与的免疫反应结果。CD病人的肠道淋巴瘤也是来自IEL增殖。器官移植后的宿主排异反应、结肠炎、热带性腹泻、牛奶过敏和某些自身免疫性疾病均有IEL增加。也有人发现克隆氏病和溃疡性结肠炎患者结肠IEL细胞毒性作用明显减弱。当然,IEL增加是继发或是原发,是否IEL是这些疾病的病因,临床治疗和诊断价值如何,还不清楚。而且IEL受年龄、抗原、免疫调节 剂等因素影响,因此需要深入进行研究。

二、组织材料的处理

2.粘膜固有层T淋巴细胞在局部体液免疫中起重要调节 作用在GALT中有开关性T淋巴细胞使生发中心的淋巴母细胞转化成IgA产生细胞。这些细胞减少或功能缺乏可导致免疫球蛋白A缺乏。有人分离出克隆氏病和溃疡性结肠炎病人固有层T淋巴细胞进行研究,发现辅助性T淋巴细胞减少,抑制性T淋巴细胞显著增加,可能导致局部免疫失调,引起细胞毒性或迟发性过敏反应等,致使炎症和溃疡发生。

组织材料的处理是获得良好免疫组织化学结果的前提,必需保证要检测的细胞或组织取材新鲜,固定及时,形态保存完好,抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏。

3.胃肠道肿瘤细胞中T淋巴细胞研究倍受重视我们及国内外一些报道均证明胃癌组织中T淋巴细胞显著增加,且其细胞毒性大于非癌组织。胃癌病人周围血T淋巴细胞毒性低于粘膜T淋巴细胞。但有人发现胃癌组织中T淋巴细胞的ADCC作用较弱。提示粘膜T淋巴细胞可能直接通过细胞毒作用或通过释放淋巴因子对癌细胞有杀伤作用。近年来有人将癌组织中提取和分离出具有细胞毒作用T淋巴细胞,体外加入IL-2,促其增殖,再注入病人体内进行治疗,取得明显疗效。

三、免疫染色

4.上皮细胞的MHC表达也与临床疾病密切相关有人发现克隆病、溃疡性结肠炎、放射性和感染性结肠炎和结节 病性肠炎患者小肠和结肠HLA-DR明显增加,而且不成熟的腺体隐窝细胞也有表达。CD急性期和复发时HLA-DR表达明显增加,缓解期明显减少或恢复正常,说明MHC的固有性和变易性所导致的免疫反应的复杂性,在消化道疾病的发生和发展中起着重要调节 作用。

可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染色。一般程序是:①标记抗体与标本中抗原反应结合;②用PBS洗去未结合的成分;③直接观察结果;或显色后再用显微镜观察。在此基础上发展出间接法,多层法,双标记法等各种方法,将在本书各有关章 节 内详述。

在免疫染色中应特别注意增强特异性染色,减少或消除非特异性染色。在各种免疫染色中都必须注意以下几个问题:

1.增强特异性染色的方法

蛋白酶消化法:其作用是暴露抗原,增加细胞和组织的通透性,以便抗体与抗原最大限度的结合,增强特异性染色和避免非特异性染色。这种方法已广泛用于各种免疫细胞化学染色,常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶以及链霉蛋白酶等;也可用3mol/L尿素处理切片,达到酶消化的目的。各种酶的配制和使用方法详见附录。酶消化的时间和温度因各种抗原对消化的敏感性不同,应根据酶的活性通过预试验确定,消化的时间还与组织固定的时间有关,一般是陈旧固定组织所需时间长,以37。C为宜。消化时间短的组织可在室温中进行。消化处理时间过长能损伤组织,易使切片脱落,应使用切片粘附剂,消化时间尽量缩短。

合适的抗体稀释度:抗体的浓度是免疫染色的关键,如果抗体浓度过高,抗体分子过多于抗原决定簇,可导致抗体结合减少,产生阴性结果。此阴性结果并不一定缺少抗原,而是由于抗体过量。这种现象类似于凝集反应中的前带效应。因此,必须使用一系列稀释作“棋盘式效价滴定”检测抗体的合适稀释度,以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。抗体稀释度应根据:①抗体效价高,溶液中特异性抗体浓度越高,工作稀释度越高;②一般讲,应用的抗体稀释度越大,温育时间越长。③抗体中非特异性蛋白含量、只有高稀释度时才能防止非特异性背景染色;④稀释用缓冲液的种类、标本的固定和处理过程等也可影响稀释度。所以合适的稀释度应根据自己的情况测定。抗体的稀释主要是指第一抗体,因为第一抗体中特异性抗体合适的尝试是关键,应用高稀释度第一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应,减少或消除其中交叉抗体反应。

温育时间:大部分抗体温育时间为30-60min,必要时可4。C过夜。温育的温度常用37。C,也可在室温中进行,对抗原抗体反应强的以室温为佳。37。C可增强抗原抗体反应;适用于多数抗体染色,但应注意在湿盒中进行,防止切片干燥而导致失败。

多层染色法:对弱的抗原可用间接法、PAP和ABC法、四或五层PAP法或ABC法,或PAP和ABC联合染色法等,可以很大程度的提高敏感性,获得良好结果。

显色增敏剂的应用,如在过氧化物酶底物中加入氯化镍,可提高显色敏感度4倍。

2.减少或消除非特异性染色的方法 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色,最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入2%-5%牛血清白蛋白,可进一步减少非特异性染色。作用时间为10-20min。也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清。有明显溶血的血清不能用,以免产生非特异性染色。免疫荧光染色时,可用0.01%伊文氏兰(PBS溶液)稀释荧光抗体,对消除背景的非特异性荧光染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。洗涤用的缓冲液中加入0.85%~1%NaCl成为高盐溶液,充分洗涤切片,能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。

3.显色反应的控制 免疫酶染色应注意控制:①成色质浓度和温育时间可调节 ,增加成色质的量和/或增加底物温育时间,可增加反应产物强度。着色太深可减少温育反应时间。②过氧化物酶显色时,H2O2较大浓度将使显色反应过快而致背景加深;过量H2O2可能抑制酶的活性。

4.复染 根据所用的染色方法和呈显颜色等,可选用适当的复染方法。如阳性结果呈红或棕色,则用苏木素将细胞核染成兰色,以便定位检测。也可用1%~2%甲基绿复染。

四、对照

其目的在于证明和肯定阳性结果的特异性,排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照,常用的对照方法包括:①阳性对照;②阴性对照;③阻断试验;④替代对照;⑤空白对照;⑥自身对照;⑦吸收试验。

阳性对照

用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色,对照切片应呈阳性结果,称为阳性对照。证明全过程均符合要求,尤其当待检标本呈阴性结果时,阳性对照尤为重要。

阴性对照

用确证不含已知抗原的标本作对照,应呈阴性结果,称阴性对照,是阴性对照的一种。其实空白、替代、吸收和抑制试验都属阴性对照。当待检标本呈阳性结果时,阴性对照就更加重要,用以排除假阳性。对照的具体方法步骤,在有关章 节 详述。

五、免疫细胞化学结果的判断

对免疫细胞化学结果的判断应持科学的慎重态度,要准确判断阳性和阴性,排除假阳性和假阴性结果,必须严格对照实验,对新发现的阳性结果,除有对照试验结果之外,应进行多次重复实验,要求用几种方法进行验证,如用PAP法阳性,可再用ABC法验证。必须学会判断特异性染色和非特异性染色,对初学者更为重要,否则会得出不科学的结论。特异性染色与非特异性染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位,如胞浆内,也有分布在细胞核和细胞表面的,即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。非特异性染色表现为无一定的分布规律,常为某一部位成片的均匀着色,细胞和周围的结缔组织均无区别的着色,或结缔组织呈现很强的染色。非特异性染色常出现在干燥切片的边缘,有刀痕或组织折叠的部位。在过大的组织块,中心固定不良也会导致非特异性染色。有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在,由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察和记录,而且令人对其特异性结果产生怀疑。

阳性细胞的染色特征

免疫细胞化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量,可作为定性、定位和定量的依据。

阳性细胞染色分布有三种类型:①胞浆;②细胞核;③细胞膜表面。大部分抗原见于细胞浆,可见于整个胞浆或部分胞浆。

阳性细胞分布可分为烟性和弥漫性。

由于细胞内含抗原量的不同,所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同,常提示其反应为非特异性。

阳性细胞染色定位于细胞,且与阴性细胞相互交杂分布;而非特异性染色常不限于单个细胞,而是累及一片细胞。

切片边缘、刀痕或皱折区域,坏死或挤压的细胞区,胶原结缔组织等,常表现为相同的阳性染色强度,不能用于判断阳性。

染色失败的几种原因

所染的全部切片均为阴性结果:包括阳性对照在内,全部呈阴性反应,原因可能是:①染色未严格按操作步骤进行;②漏加一种抗体,或抗体失效;③缓冲液内含叠氮化钠,抑制了酶的活性;④底物中所加H2O2量少或失效;⑤复染或脱水剂使用不当。

所有切片均呈弱阳性反应:①切片在染色过程中抗体过浓,或干燥了;②缓冲液配制中未加氯化钠和pH值不准确,洗涤不彻底;③使用已变色的呈色底物溶液,或呈色反应时间过长;④抗体温育的时间过长;⑤H2O2浓度过高,呈色速度过快;⑥粘附剂太厚。

所有切片背景过深;①未用酶消化处理切片;②切片或涂片过厚;③漂洗不够;④底物呈色反应过久;⑤蛋白质封闭不够或所用血清溶血;⑥使用全血清抗体稀释不够。

阳性对照染色良好,检测的阳性标本呈阴性反应,固定和处理不当是最常见的原因。

对于阳性结果的定量判断常规方法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计数,以、+、++、+++等分级和计数统计。现在已采用图象分析计量,本书第九章 将详细叙述这种使免疫细胞化学的定量成为可能的先进的形态定量方法。另外,第十章 将详细途述另一种先进的免疫细胞化学计量分类术-流式细胞光度计技术。

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