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胃肠道粘膜抗体产生细胞,胃肠道粘膜T淋巴细胞大赢家比分:

抗体产生细胞即光镜下所见浆细胞。有的呈圆形,核居中,也有的呈椭圆形,核偏于一边。它们都具有丰富胞浆,能产生和分泌各种抗体。一个成熟浆细胞只能分泌一种抗体。胃肠道粘膜中的各种抗体多由局部抗体产生细胞所分泌。一般认为骨髓的多潜能干细胞转化成细胞表面具有IgM和IgD标记的成熟B淋巴细胞后进入粘膜层或粘膜下层的散在淋巴滤泡或Peyer斑的生发中心。胃肠腔内抗原通过其靠腔面的M细胞进入粘膜固有层,通过巨噬细胞和树突状细胞将抗原加工后传递至生发中心,在转化生长因子β(β-trans-forming growth factor, TGF-β)、IL-4、IL-5、γ-IFN和抗原刺激下B淋巴细胞增殖并转移化成细胞表面含IgG、IgA、IgE等特异性B淋巴母细胞,一部分直接分散在固有层,大部分经淋巴细胞再循环返回胃肠道粘膜,在IL-2和IL-6刺激下转化成抗体产生细胞,分泌特异抗体,发挥体液免疫反应。因此测定粘膜中抗体产生细胞的分布对进一步认识局部体液免疫反应与胃肠道疾病的关系有重要意义。

胃肠道T淋巴细胞分布在上皮层、固有层、粘膜集合和散在淋巴滤泡及肠系膜淋巴结内。随着免疫细胞化学技术广泛应用和各类T细胞亚群单克隆抗体的制备成功,为进一步研究不同部位T淋巴细胞的分类和功能起极其重要的作用。

胃肠道产生的分泌性IgA在其粘膜表面形成重要的免疫保护层能防止抗原性物质进入粘膜,对局部炎症和肿瘤的发生发展起重要作用,也是近年来研究局部粘膜免疫反应的重要课题。

癌胚抗原是分子量约20万的糖蛋白,具有二级以上结构。不同肿瘤中提取的CEA虽然抗原性相似,但所含唾液酸及其它糖组分的含量不一定相同,故有多个抗原决定簇,能与非特异性反应抗原NCA、NCA-2和正常胎儿粪抗原等发生交叉反应。NCA存在于正常肺、胰腺、粒细胞、单核细胞及巨噬细胞内,也存在于正常肠粘膜、胃粘膜肠化生腺体细胞及胆汁内。临床血清学检查CEA对结肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌及其它腺上皮性恶性肿瘤等的诊断有较大价值。免疫细胞化学研究可以明确CEA的定位和分布,也可以通过组织切片和分泌物涂片进行临床诊断和鉴别诊断。

二、双标记免疫荧光染色

1.上皮内T淋巴细胞上皮内淋巴细胞是指位于上皮层基底部的T淋巴细胞。近年来,对IEL对邻近上皮细胞有压迹,位于两个上皮细胞交界处,并未进入上皮细胞内。近年来,对IEL研究非常深入。已经证实75%以上成人小肠IEL是TCRγαβ阳性细胞,说明它们来源于胸腺,接受过抗原刺激。其中大部分为诱导、杀伤性T淋巴细胞,10%左右为CD7阳性和CD3阴性的IEL,类似NK细胞,有细胞毒作用,但无NK细胞标记,对NK的靶细胞无破坏作用。10%~20%左右为TCRδ阳性IEL,不受胸腺的影响,其中70%CD4和CD8均阴性,为T淋巴细胞前体。说明人的部分IEL通过胸腺外途径进行分化。内毒素等腔内抗原与肠上皮细胞微绒毛、肠腺隐窝细胞、巨噬细胞和树突状细胞膜上的组织相关性抗原分子相结合后,将抗原分子传递到CD3阳性T淋巴细胞受体中的α和β亚单位可变区进行结合,在CD8分子作用下导致IEL增殖和分泌大量γ-干扰素,α-肿瘤坏死因子,和少量的白介素-2,发挥细胞毒性作用,调节 上皮细胞再生和增强对食物抗原的耐受。

一、S IgA合成及其功能

二、癌胚抗原的免疫细胞化学染色

抗体产生细胞胞浆内含有相对多的抗原,故采用直接或间接法免疫细胞化学技术可简化步骤,节 省时间,降低成本。为了清除组织间弥散的免疫球蛋白,我们在固定前用PBS浸洗,取得良好的效果。用双标记免疫荧光技术可以在同一张切片上显示出两种不同的抗体产生细胞。

2.固有层T淋巴细胞固有层T淋巴细胞分散在固有层,约占固有层免疫细胞总数10%左右。其中CD4阳性细胞显著多于CD8阳性细胞。40%CD4LPL表达CD45RO抗原,能产生大量IL-2、IL-4和γ-INF,为记忆性T淋巴细胞,能辅助B细胞转化成抗体产生细胞并促其分泌抗体。60%CD4LPL表达CD45RA和CD8抗原,能直接抑制抗体产生细胞转化和分泌。这两种细胞的比例在调节 抗体分泌中起着重要作用。CD8LPL也可以分两种:一种表达CD28抗原的LPL,能通过ADCC或直接溶解靶细胞。另一种表达CD16抗原,具有自然杀伤功能。LPL能被IL-2激活,激活的LPL能释放大量IL-2、IL-4、γ-INF和IL-5、IL-2又能激活LPL,起着自身分泌作用。IL-5能促进抗体产生细胞分泌抗体。

人体内主要含有两种形式IgA。一种为s IgA单体,主要存在血清中,多来自脾脏、骨髓和肠系膜淋巴细胞的浆细胞。另一种是与分泌成分结合的二聚体,即SIgA,沉降系数为11S,主要存在唾液、初乳及胃肠道等分泌液中。成人肠道每天能分泌3gSIgA。目前多认为胃肠道是s IgA的中枢器官。SIgA由SC、J链和二个IgA单体组成,形成过程包括:SC的合成、J链和IgA合成、IgA与SC结合和SIgA分泌。SC是分子量为83000dalton左右的糖蛋白,由549~558个氨基酸和20%糖组成,其转录基因在上皮细胞的第1对染色体上。我们用免疫细胞化学染色证实SC主要分布在分泌性腺上皮细胞基底侧膜及游离腔面的胞浆内。杯状细胞含SC很少。SC作为免疫球蛋白的受体在SIgA的合成中起重要作用。目前已经证实SC与胃肠道固有层IgA产生细胞分泌的二聚体和J链形成二硫键。虽然40%IgG和IgD产生细胞也含有J链,但很快被溶解,故SC不能与IgG与IgD相结合。SC能与IgM五聚体结合,但结构不稳定,易被消化酶破坏。SC与IgA结合及SIgA分泌过程是近年来研究的重点课题。SC作为特异性受体位于上皮细胞膜上,其膜外部分非共价键与J链和IgA的α链可变区结合,SC紧靠细胞膜部分与IgA二聚体的另一条链α链形成二硫键。结合的SIgA通过细胞吞饮作用进入胞浆,在上皮细胞腔面释放,近年的研究表明,小白鼠的肝细胞和人胆管上皮细胞也能合成SC。人胆汁中含有IgA单体多来自血液,少部分来自门脉区及胆管内皮细胞下浆细胞。有趣的是有人发现慢性肝硬化患者周围血B淋巴细胞也能产生IgA二聚体,其机理还不清楚。

1.组织加工有人提出用冰冻切片进行CEA免疫细胞化学染色。由于非特异性荧光和需要一定设备条件,有人改用福尔马林固定和胰酶消化的方法。从我们的体会看,福尔马林固定后的切片CEA的部分抗原决定簇被遮盖,阳性结果显着受到影响。但是用冷酒精固定后的组织切片,CEA的阳性率明显升高,而且结果仍很清晰。goldenbery等同时进行CEA酶标记组织,而福尔马林固定的组织切片中CEA检出范围为3.0~7.0ng/g组织,酒精固定的组织切片比福尔马林固定者敏感2~3倍。有趣的是我们用酒精固定26个月的切片进行染色,效果仍然很好。说明冷酒精固定法便于进行回顾性研究。虽然酒精固定后组织收缩比较明显,但不影响组织结构及形态,而且可以进行多种抗原的定位研究,操作简单,是值得推荐的一种组织固定方法。冷酒精固定方法和步骤同抗体产生细胞的研究。

1.组织加工根据研究目的的内窥镜直视下钳取胃、小肠或结肠粘膜。将取得的组织立即放入含4℃,pH7.2、0.01mol/l PBS烧杯内搅拌10~18h后直接放入4℃、96%乙醇中固定。在4℃环境下继续脱水和透明,56℃浸蜡和包埋,石蜡块冰箱保存。组织切片后,37℃温水展平,载片后干燥,装干燥盒置于冰箱,可以保存1周左右。4℃脱蜡和脱二甲苯,PBS洗涤后蒸馏水清洗,风干待染。

3.胃肠道相关淋巴组织T淋巴细胞胃肠道相关淋巴样组织主要包括肠系膜淋巴结和粘膜中集合和散在淋巴滤泡。GALTT淋巴细胞多们于生发中心的外周部位,约占40%。其中CD8和CD4阳细胞比例与周围血相似。动物研究证明,肠系膜淋巴结内的CD4阳民生细胞多于固有层。分子生物学研究发现GALTT淋巴细胞含有IL-4和IL-5基因,激活后产生大量IL-4和IL-5,能特异性增加B和T淋巴细胞增殖。抑制B淋巴细胞分化。其表面糖蛋白主要为CD45RA和leu8(CD8),证明是幼稚T淋巴细胞。它们对抗原刺激的增殖反应低,对刀豆素A等有丝分裂促进剂的增殖反应高,产生IL-2和γ-INF低,辅助作用弱。GALTT淋巴细胞如何调节 B淋巴细胞转化成IgA产生细胞和其它免疫细胞的增殖及功能,并不十分清楚。有待进一步研究。

SIgA分布在粘膜表面,能封闭细菌和病毒等抗原表面及其受体结合部位或与之凝集成团状,阻止病毒和细菌和粘附。SIgA与相应抗原结合还可激活补体的替代途径,造成抗原溶解,近年来也有人发出IgA也能通过ADCC发挥细胞毒作用。有人发现先天性缺乏SIgA的病人恶性肿瘤的发病率比正常人高20~50倍。小肠之所以很少发生恶性肿瘤,粘膜中含85%以上的IgA产生细胞是重要因素之一。因此,深入研究SIgA与消化道炎症,感染和肿瘤发生发展的关系有临床实用价值。

2.染色方法的选择根据实验条件和抗体特点选择染色方法。PAP和ABC技术可以采用,但试剂价格较昂贵,步骤较复杂。我们认为间接荧光或间接酶技术即可获得满意结果。间接酶染色技术步骤如下:

2.荧光素标记抗体 异硫氰酸荧光素标记抗体的具体步骤详见第三章 。在标记络丹明B200时应注意:

近年研究发现,除M细胞和巨噬细胞外,胃肠上皮细胞在接受和传递抗原中也起重要作用。免疫细胞化学发现正常小肠上皮细胞微绒毛和侧膜有斑片状MHc II类抗原,人小肠为HLA-DR糖蛋白,能识别、加工和传递抗原使粘膜内T淋巴细胞产生免疫反应。HLA-DR表达受γ-IFN诱导。因此免疫反应中组织相关性抗原与IEL和LPL淋巴细胞互相进行调节 。

二、对比免疫荧光染色

冷酒精固定的组织石蜡包埋,组织切片,常规脱蜡后在PBS中放置5min,过一次蒸馏水清除玻片上的沉淀物后风干,加含3%H2O2甲醇一滴在切片上,放置20min后再PBS冲洗3次,过蒸馏水后风干。

PCI5极易吸收水份放出烟雾样刺激气体,RB200和丙酮混合后搅拌时也放出有毒的SO2Cl刺激性气体,故操作时最好在通风橱内进行。在室外操作时应戴口罩。

二、研究方法

1.染色特点

加稀释好的兔抗CEA血清在37℃湿盒内放置45min。

丙酮极易挥发,一定要在密闭容器内搅拌。吸取丙酮时也要动作迅速。

1.组织切片中T淋巴细胞80年代以前多用玫瑰花瓣试验和酸性酯酶方法进行组织切片中T淋巴细胞研究,特异性较差。近年来多用OKT,Leu或CD等系列T淋巴细胞单克隆抗体进行研究,特异性高,可以分类出各种亚群。免疫组化染色中应注意以下几个方面:

要进行SC和IgA组织定位,必须有相应特异抗血清。SC抗血清国内没有生产。国内商品IgA抗血清的抗原多来自人乳中的SIgA,具有双重抗原性,不能特异进行IgA组织定位,最好采用抗人α-重链抗血清。

PBS清洗3次后风干,再加HRP标记物的羊抗兔IgG,37℃湿盒内放置45min。

在标记过程中,RB200能产生HCl,容易使蛋白变性,必须用较多碱性缓冲液中和。具体步骤是:

抗体的选择:根据不同目的选择相应的抗体,如要对人胃肠道组织进行研究,可选用OKT系统单抗;对鼠类等进行研究可选用Leu 或Thy系列。如要研究辅助性T淋巴细胞可用OKT4或CD4;研究抑制性T淋巴细胞可用OKT8或CD8等单克隆抗体。

SC是糖蛋白,IgA是免疫球蛋白。在组织处理上虽然有人提出用冷冻切片或福尔马林固定胰酶消化的方法,我们的体会用冷酒精直接固定法既简单又方便。

PBS清洗3次后加新鲜配制的含3%H2O2pH7.6Tris缓冲液中暗处反应5~8min,自来水冲洗,用1%甲基绿复染2~5min,再次自来水冲洗,常规脱水、透明和封片,在光镜下观察。

①按50mg蛋白需10mg RB200和20mg PCI5的比例分别准确称取PCl5和RB200,放入青霉瓶内。经橡皮塞穿入玻棒拌混合5min。

组织加工方法选择:目前所研究的特异性T淋巴细胞抗原决定簇多位于细胞膜上,用陈旧或普通组织固定和加工方法可能使抗原破坏,应采用新鲜组织和低温处理。具体方法是:手术或活检获得的组织立即用液氮冷冻,或用OCT复合物包埋后再放入液氮中,便于切片,Cryostat冰冻切片后室温下风干,用4℃纯乙醇或丙酮固定10min,PBS冲洗后即可进行免疫细胞化学染色。

SC和IgA除一部分在细胞内,也可以分布于间质和粘膜表面。为了提高特异性,除了染色前用琼脂扩散、对照试验、吸收试验和抑制试验等方法检验抗体的特异性和敏感性外,可采用伊文氏蓝作对比染色。伊文氏蓝肉眼下是蓝色,在荧光镜下是红色,混合染色后能衬托FITC的绿色荧光,同时抑制非特异性荧光,不影响抗原抗体结合。如果特异性染色后再加伊文氏蓝,比较费时间,效果不一定最佳。先用伊文氏蓝染组织切片,再进行特异性抗体染色能抑制抗原抗体结合,不宜使用。

3.阳性结果判断及计数检查前应当对CEA的分布有一定理性认识,而且用正常结肠组织和阳性组织作对照观察。CEA以三种形式出现在胃肠道组织切片中:①腔面分布。沿腺腔面的胞浆有棕红色酶着色。这是胃粘膜中肠上皮化生腺体、高分化腺癌和正常结肠腺体的CEA分布形式。②胞浆分布。在低分化粘液细胞癌中,CEA多位于胞浆。③粘液分布。在高分化腺癌的腺腔和粘液细胞癌周围的粘液中有CEA着色。

②用吸管吸取0.5ml左右丙酮迅速注入瓶内,继续搅拌5min形成紫褐色溶液。

染色方法的选择:因抗原较微量,而且位于细胞膜,应采取敏感性强、特异性高、非特异性着色少的方法。虽然有报道采用间接荧光或间接酶标技术也能显示特异性T淋巴细胞,我们推荐最好采用PAP或ABC染色技术。具体方法参阅第三,四章 。

2.染色步骤

4.腹水免疫细胞化学染色临床上鉴别良恶性腹水可采用免疫细胞化学技术。抽取200~300ml腹水,离心后取细胞沉淀进行直接涂片、干燥、酒精固定后采用间接荧光染色。具体的方法是:在腹水涂片上加兔抗CEA抗血清,在37℃湿盒内放置45min后BPS冲洗,共10min,再加入FITC标记的羊抗兔IgG,在37℃湿盒内放置45min后,PBS冲洗3次,共10min,用50%甘油封片,荧光显微镜观察。有绿色荧光阳性细胞的片子再进行HE染色,做对照观察和判断。也可以将细胞沉淀物在试管内直接进行间接荧光染色。我们发现,不论采用哪种方法,都可能出现非特异性着色。少数淋巴细胞也能出现荧光或酶着色。其机理尚不清楚,如果采用伊文氏蓝作对比荧光染色,可明显减少非特异性荧光,而且淋巴细胞较小,腺癌细胞较大,有利于进行鉴别诊断。

③1份抗血清用等量或2份0.5mol/l p9.5碳酸缓冲液稀释后在4℃冰箱内用磁力搅拌器边搅边加入A液,并用混合液反复冲洗青霉素瓶内的A液,直至干净为止,然后继续搅拌30~60min。

2.粘膜分离液中T淋巴细胞一定重量粘膜组织中分离出来的T淋巴细胞也可以用免疫细胞化学进行定量和定性研究。下面介绍用间接免疫荧光技术研究IEL的大致过程:

组织加工、固定及切片与抗体产生细胞研究相同。先做HE染色,选纵向连续切片,脱蜡后在4℃PBS中浸洗3~5min,过一次蒸馏水后风干待染。

三、临床意义

④称取相当于蛋白半量的活性碳加入混合液内继续搅拌60min后,以4000r/min离心30min除去活性碳。

将手术取得的肠管纵形剪开,将上皮层与固有层分离。

用伊文氏蓝PBS稀释FITC标记的SC和IgA抗体,加在连续组织切片上,放入湿盒,37℃温箱放置45min。

免疫细胞化学技术可以确定CEA的组织发生部位,根据阳性特点可以判断癌细胞的位置。我们的研究发现正常结肠组织CEA为弱阳性,多非常清晰分布在腔面。但结肠癌组织中CEA着色带较宽,多为强阳性,而且不规整。对胃粘膜的研究发现正常胃腺体均为阴性,肠化生腺体细胞弱阳性。胃腺瘤细胞也含有CEA。70%以上胃癌细胞CEA强阳性,特别是粘液细胞癌,光镜下癌细胞分散浸润,无法确定其转移及浸润范围。用免疫荧光或免疫酶技术进行染色,根据阳性细胞分布可作出正确判断。在肝脏或其它部位转移癌有时因细胞分化不良,无法确定其组织来源。如果用免疫细胞化学染色,发现CEA阳性细胞说明来源于腺上皮的癌肿,可能来自胃肠道或卵巢等组织。用胸腹水进行免疫细胞化学染色对临床诊断有实用价值。Walts对26例肿瘤病人渗出液和抽吸液离心后做免疫酶染色,发现13例有CEA阳性细胞。11例常规细胞学检查阴性的肿瘤病人发现8例胸腹水中有CEA阳性细胞。如果胆高CEA抗体的特异性,改进组织加工方法,排除非特异性着色,可望提高诊断价值。已经有人在血清学监测CEA诊断胃肠道肿瘤的基础上,将CEA标记125I进行放射扫描定位诊断和用CEA标记131I或抗癌药物进行肿瘤治疗的报道。

⑤用30%~50%饱和硫酸铵盐析1次,去上清液,沉淀物用少量PBS溶解,过G-25层析柱去除硫酸铵即得RB200标记的抗体。

上皮层放在无镁离子、含100U青霉素和链霉素及0.2%叠氮纳的PB中清洗,无血液和其它杂质后用解剖剪将组织剪碎,用匀浆器磨碎或用超声粉碎或用胶原酶溶解上皮细胞。

取出切片,用BPS浸洗3次,每次5~10min。

⑥RB200的最大吸收光谱为570。用分光光度计分别测定570nm和280nm的读数,根据Wells表算出F/P克分子比值。

匀浆液通过脱脂棉、尼龙筛或金属网获得淋巴细胞悬液。

过一次蒸馏水后风干,50%甘油封片,荧光显微镜观察。

⑦效价高的标记抗体加0.1% NaN3或硫柳汞数滴防腐,分装放置20℃以下可长期保存,4℃~10℃能保存半年左右。

将硅化玻璃球高压消毒,冲洗和平衡后将悬浮液过柱,得到的细胞液直接计数。也可以用淋巴细胞分离液提取,用台盼蓝测定其活性,并加10%FCS-RPMI细胞培养液,淋巴细胞数应达5×106/ml。

3.结果判断和分析荧光镜下组织切片底色为红色荧光,SC和IgA呈绿色荧光。IgA和SC主要分布在分泌性腺体腔面、上皮细胞侧膜及基底部,IgA还分布在间质及固有层IgA产生细胞浆内。可根据荧光强度进行SC和IgA半定量分析,也可以用荧光光度计或数字减影技术进行准确定量。

3.染色步骤染色前进行对照试验、吸收试验和抑制试验,测定抗体的纯度和特异性,同时以琼脂扩散和染色效果确定工作效价。在连续切片中,用RB200标记的IgG稀释液分别与FITC标记的IgA和IgM混合进行染色。在37℃温盒内孵育45min,PBS清洗,过一次蒸馏水后风干,50%缓冲甘油封片,在冰箱中可保存10天左右。

试管内加0.1ml细胞液后加OKT系列单抗0.1ml,同时用另一试管加0.1mlPBS作对照。混合液在4℃放置30~60min后,PBS冲洗3次,离心后细胞沉淀物再加PBS至0.1ml。

三、临床意义

4.阳性结果观察及细胞计数用Olympus荧光显微镜观察。选择BG12激发滤板和0515抑制滤板可同时观察两种荧光。胞浆丰富、明显绿色荧光、核不着色的细胞为IgA或IgM产生细胞;胞浆红色荧光者为IgG产生细胞。少数胞浆黄色荧光的细胞核呈圆形,位于细胞中央,可能这些B淋巴母细胞能产生两种抗体,也可能是具有共同的轻链而引起的交叉反应。如果用α、β、γ、μ、δ等重链单抗进行研究,可以进行鉴别。在荧光显微镜下数出组织切片中阳性细胞总数,测微器放在目镜下测出组织切片所占小方格数。测微器小方格边长为0.5mm,根据物镜放大倍数用公式D=64N/P计算出每平方毫米组织切片中所含细胞数。

加0.1mlFITC标记的抗鼠IgG,4℃放置20~30min,PBS洗3次,离心后加在红细胞计数板上,荧光显微镜观察。

1.胃十二指肠疾病我们用免疫荧光技术对胃和十二指肠疾病研究结果与Isaonacs相似,发现正常胃粘膜中胃体腺没有IgA和SC分泌,仅上皮层有少量IgA和SC荧光。胃窦腺体细胞的腔面及侧膜均有SC和IgA,间质有IgA荧光,但没有SC荧光,上皮层SC和IgA荧光较胃体强,证实SC为粘液分泌性腺体细胞所产生,在细胞侧膜与IgA结合。正常十二指肠上皮细胞层SC和lgA特别丰富。粘膜下层十二指肠体腔面也有SC和lgA分布,但较因有层腺体细胞的分泌能力低。杯状细胞缺乏分泌SC的能力。这可能与HLA-DR组织相关抗原有关。上皮层的SIgA可能是分泌后的功能定位。正常胃体能分泌盐酸和胃蛋白酶,细菌或病毒感染机会少。胃窦特别是十二指肠粘膜多偏碱性环境,细菌和病毒等停留机会较多,SIgA增多可代偿性增加粘膜免疫保护功能。

三、临床意义

阳性细胞为细胞膜上有绿色荧光,有的呈颗粒样,随细胞滚动。荧光镜下可计算200个淋巴细胞中阳性细胞所占的百分率,或根据血细胞计数板中阳性细胞算出细胞总数及百分率。

慢性浅表性胃炎时,腺体和上皮层SC及IgA荧光明显增强。HE染色发现部分胃体腺转化成粘液分泌性腺体即具备分泌SC和结合IgA的能力。间质出现较多IgA产生细胞。这些病人可能正常粘膜屏障功能被破坏以SIgA免疫屏障功能代偿。

抗体产生细胞主要分布在粘膜固有层。IgA产生细胞多沿上皮层分布,IgG和IgM产生细胞分布全固有层。小肠粘膜含抗体产生细胞增多,胃和结肠其次,食管最少。小肠粘膜中IgA、IgM、IgG产生细胞比例为81.9:15.7:2.5,IgA产生细胞最多,IgG产生细胞最少。结肠粘膜中抗体产生细胞分布与小肠相似,但IgM和IgG产生细胞数增加。对于胃粘膜各家报道不一。多数认为IgA产生细胞最多,IgG产生细胞其次,IgM产生细胞最少,胃体和胃窦无显着差异。我们的结果与国外报道一致。正常胃肠粘膜中IgD产生细胞极少,IgE产生细胞仅占2%,胃粘膜中多于结肠粘膜。这些抗体产生细胞分泌的抗体在粘膜局部免疫起着极其重要的作用。某些消化道疾病与抗体产生细胞数量、分布和比例的异常密切相关。

三、临床意义

在萎缩性胃炎中,正常腺体分泌SC功能增强,但肠上皮化生腺体及不典型增生腺体的SC荧光明显减弱。从免疫学角度支持肠上皮化生与胃癌的发生有较密切关系。

1.抗体产生细胞与胃部疾病70年代国外就重视慢性胃炎和胃溃疡组织中抗体产生细胞研究。多数报道认为表浅性胃炎以IgA和IgM产生细胞增加为主,轻度萎缩性胃炎以IgA产生细胞增多,可能与细菌或病毒等感染有关。中度以上萎缩性胃炎和恶性贫血病人胃粘膜中IgG产生细胞显著增加。部分病人有壁细胞、胃泌素细胞、内因子或胃组织其它成分的自身抗体。IgG产生细胞增加可能与特异性免疫反应有关。有人将壁细胞抗体阳性病人胃粘膜中分离出IgG与壁细胞共同培养,能直接破坏壁细胞。我们的结果还发现,中度以工萎缩性胃炎患者胃粘膜中T淋巴细胞和IgG产生细胞均增加,提示胃粘膜的萎缩不能排除抗体依赖的细胞毒作用的结果。部位原发性变异性低丙种球蛋白血症患者整个胃粘膜萎缩,粘膜中缺乏抗体产生细胞。对于胃溃疡,有人认为IgA、IgM和IgG产生细胞均增加,它们之间的比例是相对正常的,但IgE产生细胞明显增加。用放射免疫法测定也发现胃溃疡病人血清和胃液中IgE浓度也增高。推测IgE作用于肥大细胞后释放组织胺类物质在溃疡的病因中起重要作用。

1.IEL在胃肠道粘膜中起重要免疫屏障作用正常成人空肠100个上皮细胞有20个IEL,回肠有13个,结肠只有5个,这也可能是恶性肿瘤不发生在小肠的重要因素之一。我们发现胃粘膜也有IEL。在胃部炎症和溃疡时,上皮及腺体隐窝细胞间的IEL明显增加。IEL不但参与免疫反应,而且通过伪足与上皮细胞接触,加速上皮细胞再生。电镜下胃粘膜也发现这种现象。IEL与乳糜泻关系最密切。近期研究表明,第12型腺病毒与麦胶蛋白有同源性。CD病人肠道感染这种病毒后,服用麦胶数小时粘膜中IEL显著增加。在上皮细胞HLAII抗原糖蛋白分子作用下与TCR结合,激活TCRαβlEL,发挥细胞毒作用,导致肠粘膜萎缩,引起脂肪吸收不良和腹泻等一系列临床症状。增加的TCRγδIEL调节 TCRαβ的杀伤作用。停服含麦胶食物后,TCRαβIEL明显减少,上皮细胞再生恢复,临床症状消失。CD病人出现疣状胃炎也是IEL参与的免疫反应结果。CD病人的肠道淋巴瘤也是来自IEL增殖。器官移植后的宿主排异反应、结肠炎、热带性腹泻、牛奶过敏和某些自身免疫性疾病均有IEL增加。也有人发现克隆氏病和溃疡性结肠炎患者结肠IEL细胞毒性作用明显减弱。当然,IEL增加是继发或是原发,是否IEL是这些疾病的病因,临床治疗和诊断价值如何,还不清楚。而且IEL受年龄、抗原、免疫调节 剂等因素影响,因此需要深入进行研究。

胃癌的发生和发展与SC和IgA的关系日益受到重视。在我们的研究中,发现部分癌细胞能分泌SC,与肿瘤的分化程度和组织分类无明显关系。临床上可以用SC鉴别其它部位转移肿瘤是否来自胃肠道,但也有人持不同的看法。肿瘤组织中IgA来源及s IgA在癌组织中的功能尚待进一步研究。

2.抗体产生细胞与胃肠道恶性肿瘤1977年日本奥田晃三首次用免疫荧光法对89例进展期胃癌的抗体产生细胞进行测定,发现IgA、IgG和IgM产生细胞均明显减少,且与胃癌的分型和组织分类无关。我们对48例胃癌组织用双标记免疫荧光研究发现癌组织中IgA产生细胞显著减少,但IgG产生细胞显著增加,并有聚集现象;癌旁组织中抗体产生细胞增加更显著,其中IgG产生细胞增加6.2倍,肠型胃癌中IgG产生细胞显著多于胃型胃癌,肿块越大则IgG产生细胞越少。Jonder证实人类肿瘤细胞膜上有IgG的FC受体。有人将小白鼠肿瘤组织中的IgG提取证实为IgG2,在细胞培养中对癌细胞有杀伤作用。提示IgG产生细胞与抗胃癌免疫反应密切相关。我们还发现胃癌组织中IgA产生细胞只占28.5%,癌旁占40.2%,显著低于正常。IgA产生细胞减少可导致SIgA合成减少,引起粘膜免疫屏障功能失调。也有人认为肿瘤细胞产生某种抑制因子阻碍IgA产生细胞进入癌组织内。其确切机理仍在深入研究中。近年来,对肠癌组织中抗体产生细胞研究也有报道。发现癌组织中IgA产生细胞也显著减少,癌旁组织中IgG产生细胞增加13倍。认为与结肠癌特异性抗原或IgG的细胞毒作用密切相关。今后的研究在于从组织中分离出抗体的特异性部分在体外或体内直接作用于肿瘤细胞,筛选出能破坏癌细胞的抗体及其基因组,用分子生物学技术扩增,用于肿瘤的治疗。

2.粘膜固有层T淋巴细胞在局部体液免疫中起重要调节 作用在GALT中有开关性T淋巴细胞使生发中心的淋巴母细胞转化成IgA产生细胞。这些细胞减少或功能缺乏可导致免疫球蛋白A缺乏。有人分离出克隆氏病和溃疡性结肠炎病人固有层T淋巴细胞进行研究,发现辅助性T淋巴细胞减少,抑制性T淋巴细胞显著增加,可能导致局部免疫失调,引起细胞毒性或迟发性过敏反应等,致使炎症和溃疡发生。

2.肠道疾病溃疡性结肠炎上皮细胞具有分泌SC的功能,但固有层IgA2产生细胞和J链的合成明显减少,IgA1产生细胞增加。IgA2能对抗IgA溶解酶的在破坏,有较强的免疫保护功能。故虽然SIgA的总量没有降低,但其免疫保护功能明显减弱,导致细菌或病毒感染,引起糜烂和溃疡。也有人发现炎症性反应性不典型增生的腺体分泌SC能力明显增强,具有癌变前期的不典型增生腺体明显减弱,而且随不典型增生程度加重,分泌SC和结合IgA能力减弱越明显,说明SC的免疫组织化学染色对鉴别良恶性不典型增生有一定价值。有人认为吸烟可能抑制SIgA合成,降低结肠粘膜免疫屏障功能,引起结肠癌。多数的报道认为结肠癌细胞分泌SC能力与肿瘤分化程度有关。分化程度越低,分泌SC的功能越差。双倍染色体癌细胞分泌SC的能力明显高于多倍体癌细胞。但SC与肿瘤之间的关系及其机理都在研究中。

3.抗体产生细胞与炎症性肠病慢性溃疡性结肠炎和克隆氏病是病因未明的肠道感染性疾病。近年来有人发现炎症性肠病与肠道局部免疫反应有关。Golzayd等发现9例CUC肠粘膜中6例有大量IgA产生细胞浸润,认为可能与细菌或病毒感染有关。也有人发现以IgG产生细胞或IgE产生细胞浸润为主。Persson等报道克隆氏病的回盲部IgA产生细胞减少,IgG和IgM产生细胞增加,有人发现感染严重部位IgG产生细胞增加,粘膜完整部位IgM产生细胞最多。因此有人提出IgG和IgM能调节 局部T淋巴细胞免疫反应造成粘膜损伤,溃疡是IgE调节 的组织胺类物质释放过多和继发感染引起。也有人提出炎症性肠病虽然肠粘膜中抗体产生细胞增加,但细胞比例没有改变。因此炎症性肠病与体液免疫反应的关系仍需要进一步深入研究。

3.胃肠道肿瘤细胞中T淋巴细胞研究倍受重视我们及国内外一些报道均证明胃癌组织中T淋巴细胞显著增加,且其细胞毒性大于非癌组织。胃癌病人周围血T淋巴细胞毒性低于粘膜T淋巴细胞。但有人发现胃癌组织中T淋巴细胞的ADCC作用较弱。提示粘膜T淋巴细胞可能直接通过细胞毒作用或通过释放淋巴因子对癌细胞有杀伤作用。近年来有人将癌组织中提取和分离出具有细胞毒作用T淋巴细胞,体外加入IL-2,促其增殖,再注入病人体内进行治疗,取得明显疗效。

3.其它疾病选择性免疫球蛋白A缺乏症患者虽然肠粘膜中IgA产生细胞显著增加,因缺乏SIgA,不能中和和或制止过敏原的吸收,易发生哮喘和食物过敏;抗原抗体复合物进入体内易诱发红斑狼疮、类风湿性关节 炎和甲状腺炎等;易引起乳糜泻及梨形鞭毛虫感染;致癌病毒或致癌物质吸收增加。有人报道9例缺乏IgA患者5例发生消化道肿瘤。爱滋病患者是HIV感染所致。有人报道病人小肠末端IgA产生细胞减少和IgM产生细胞增加,明显IgA缺乏,但在直肠没有明显改变。最近曾报道SC缺乏的患者发生肠道白色念珠菌感染。这种患者血清IgA含量正常,粘膜固有层IgA产生细胞数量不减少,但肠分泌物中SIgA缺乏。可能这些IgA产生细胞不分泌IgA或上皮细胞的SC合成障碍。

4.抗体产生细胞与慢性腹泻慢性腹泻是消化道常见病,粘膜免疫功能缺陷是重要原因之一。目前认为,不论体液免疫和细胞免疫缺陷,均可引起腹泻同时伴有肠道鞭毛虫、念球菌和霉菌等继发感染,这些病人胃肠道粘膜缺乏抗体产生细胞。虽然部分病人仍有IgGT和IgM产生细胞分布,但IgA产生细胞显著减少或缺如。可见IgA产生细胞在胃肠粘膜中起重要保护作用。也有人发现病人胃肠粘膜有不典型抗体产生细胞,产生的抗体很少,可能与缺乏辅助性T淋巴细胞有关。对这类病人除给予必要的抗菌素控制继发感染外,定期补充免疫球蛋白制剂或适当使用左旋咪唑和转移因子等T淋巴细胞激活剂可能使症状得到缓解。已经有人从乳汁中提取分泌性IgA治疗顽固性小儿腹泻获得成功。α-重链病患者小肠粘膜固有层大量抗体产生细胞浸润,分泌α-重链,引起肠粘膜萎缩,也能导致吸收不良和腹泻等症状。

4.上皮细胞的MHC表达也与临床疾病密切相关有人发现克隆病、溃疡性结肠炎、放射性和感染性结肠炎和结节 病性肠炎患者小肠和结肠HLA-DR明显增加,而且不成熟的腺体隐窝细胞也有表达。CD急性期和复发时HLA-DR表达明显增加,缓解期明显减少或恢复正常,说明MHC的固有性和变易性所导致的免疫反应的复杂性,在消化道疾病的发生和发展中起着重要调节 作用。

SIgA是胃肠道粘膜第一道免疫屏障,影响因素较多。上皮细胞感染和维生素A缺乏可引起继发性SC合成减少和SIgA转化障碍。营养不良可选择性减少IgA产生细胞数量。吸烟、双苯丙酰脲等药物、精神郁抑和剧烈运动均可能影响IgA合成。因此s IgA与疾病的内在联系及其机理还需进一步深入研究。

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